7 月 22 日，昆明理工大学灵长类转化医学研究院牛昱宇教授和季维智院士领衔的研究团队在 Science Advances 杂志在线发表题为“Cloning and base-editing of GFP transgenic rhesus monkey and off-target analysis”的研究论文。该工作基于体细胞核移植（SCNT）技术，建立了一种适用于灵长类动物的单碱基编辑器脱靶检测方法 OA-SCNT，并利用该方法对腺嘌呤单碱基编辑器 ABEmax （ABE7.10的优化版本）[6]在猕猴胚胎 DNA 、RNA 水平的脱靶效应进行了系统评估（图1）。此项工作是首次在不借助于脱靶位点预测技术的情况下，在灵长类动物个体水平进行的单碱基编辑器的脱靶分析，为其在未来人类疾病治疗中的应用提供了重要参考。
单碱基编辑器（base editors）是潜在治疗由点突变产生的遗传性疾病最有效和精确的方法，由于能够在不依赖 DNA 双链断裂（DSB）的情况下实现对单个碱基的定向修改，单碱基编辑器能够最大限度的减少基因编辑中不良产物的产生。最近的研究已经成功地将单碱基编辑器应用于小鼠和猴等疾病模型的治疗，成功修复了致病基因并改善了机体健康[1-3]。然而单碱基编辑器依然存在一定的脱靶效应，并由此带来潜在的安全性问题。由于个体之间单核苷酸多态性（SNP）的存在，单碱基编辑器的脱靶效应的评估依赖于高灵敏度的检测技术，同时需要有严格的对照样本，才能够从全基因组测序数据中识别出非 sgRNA 依赖的脱靶突变。2019 年，Science 杂志上发表的两篇文章分别用不同的方法在水稻和小鼠上证明了单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应[4, 5]。由于灵长类动物在遗传和生理上与人类高度相似，在应用于临床之前，基因编辑工具在灵长类动物个体水平的效率和安全性评估显得尤为重要。
图1. OA-SCNT方法示意图
研究人员以一只表达绿色荧光蛋白（GFP）的成年转基因猕猴的体细胞作为供体核，采用SCNT方法构建克隆胚胎，在胚胎早期阶段利用单碱基编辑沉默 GFP 表达，并通过胚胎移植方法获得了被成功编辑的克隆猴，这也是首只来源于成年转基因猕猴并以单碱基编辑方法成功实现基因修饰的克隆猴（图2）。由于细胞核来自同一只动物，编辑组和对照组胚胎的基因背景完全一致，通过比对两者之间的差异便可鉴定出由基因编辑工具造成的突变。
图2. 结合体细胞核移植与单碱基编辑方法获得的克隆猕猴
研究者收集了包含克隆胚胎和克隆猴成体组织在内的样本进行全基因组和转录组测序，进而完成 DNA和RNA 水平的脱靶分析。在基因组水平，研究人员综合四种算法识别样本单核苷酸变异（SNVs），以供体细胞为参考，在编辑组样本中鉴定出脱靶突变。分析结果表明，无论是 SNV 总数还是特异的 A > G和T > C 突变数量，编辑组与对照组均没有显著差异，说明 ABEmax 系统并没有引起明显的 DNA 脱靶编辑，这一点与小鼠胚胎的结果类似[4]。然而在 RNA 脱靶分析中，编辑组的猕猴胚胎中出现了显著增加的 SNVs，且绝大多数为 A > G和T > C 突变，表明 ABEmax 会引起大规模的 RNA 变异。在基因表达总体水平相当的情况下，脱靶突变更多发生在表达量相对较高的基因，并且随机分布在不同的转录本中。此外，分析数据表明，98% 以上的脱靶突变发生在蛋白编码序列，仅 1.9% 为长链非编码 RNA（lncRNAs）。研究者进一步评估了 RNA 变异的基因与胚胎早期发育的关系，发现每个胚胎中平均有392 个脱靶突变位点发生在与胚胎早期发育相关的基因，但对基因表达量没有影响。此外，每个编辑组胚胎样本中平均有 109 个脱靶突变位点与致癌基因或抑癌基因相关，同样，这些基因的表达量与对照组相比没有显著变化，但其蛋白编码序列有可能被改变。
综上，该研究成功实现了成年转基因猕猴的克隆和单碱基编辑，并以此为基础建立了灵长类动物单碱基编辑脱靶分析方法，研究发现 ABEmax 可以在灵长类动物中诱导广泛的 RNA 脱靶突变，并有可能对胚胎早期发育产生影响或具有潜在致癌性。该研究也是首次基于灵长类个体水平的单碱基编辑脱靶效应评估，将为精准基因编辑工具的开发、优化以及临床前应用的安全性评估提供重要参考。
我院牛昱宇教授、季维智院士为本文通讯作者，康宇博士、代绍兴副教授、王芳博士、博士生曾玉强为文章的并列第一作者。
原文链接：
参考文献：
1. Rothgangl T, Dennis MK, Lin PJC, Oka R, Witzigmann D, Villiger L, Qi W, Hruzova M, Kissling L, Lenggenhager D et al: In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels. Nature biotechnology 2021, 39(8):949-957.
2. Musunuru K, Chadwick AC, Mizoguchi T, Garcia SP, DeNizio JE, Reiss CW, Wang K, Iyer S, Dutta C, Clendaniel V et al: In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates. Nature 2021, 593(7859):429-434.
3. Koblan LW, Erdos MR, Wilson C, Cabral WA, Levy JM, Xiong ZM, Tavarez UL, Davison LM, Gete YG, Mao X et al: In vivo base editing rescues Hutchinson-Gilford progeria syndrome in mice. Nature 2021, 589(7843):608-614.
4. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, Ying W, Sun H, Yuan L, Steinmetz LM, Li Y, Yang H: Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 2019, 364(6437):289-292.
5. Shuai Jin YZ, Qiang Gao, Zixu Zhu, Yanpeng Wang, Peng Qin, Chengzhi Liang, Daowen Wang, Jin-Long Qiu, Feng Zhang, Caixia Gao: Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 2019, 364(6437):4.
6. Koblan LW, Doman JL, Wilson C, Levy JM, Tay T, Newby GA, Maianti JP, Raguram A, Liu DR: Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nature biotechnology 2018, 36(9):843-846.
